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  • 分子生物学技术在白蚁种类鉴定中的应用研究
  • 黄海娣 田洁
    镇江市白蚁防治所 镇江 212003
     
    摘要:近年来随着分子生物学技术的日益发展,白蚁的分类鉴定更加快速、灵敏和可靠。本文利用分子生物学技术鉴别确认了镇江市185个白蚁标本的种类,鉴定结果包括黑翅土白蚁、黄翅大白蚁、台湾乳白蚁、黑胸散白蚁、尖唇散白蚁、圆唇散白蚁、黄胸散白蚁等,共2科4属7种白蚁。该方法具有快速、简便、样品量少、准确等优点, 适用于白蚁种类的鉴别。该研究可为进一步提高白蚁防治工作水平提供科学基础和技术支持。
     
    关键词:白蚁,分子生物学技术,鉴定
     
    1.前言
        白蚁是一种世界性重要害虫。全世界已知白蚁种类有约3000种[1],我国约400多种[2],在长江以南地区危害尤为严重。它们与人类经济密切相关,可对人类社会造成较大危害[3-4]。早期传统的形态分类法为白蚁的分类鉴定奠定了基础。白蚁的外部形态相似,目前白蚁主要依靠兵蚁或有翅成虫进行分类[5]。但是在区分一些相似种、近缘种上难度较大,容易引起误判[6-7]。同时,白蚁的形态学分类往往需要一定数量的个体,分类时个体太少则会影响结果的可靠性,而有些白蚁种群的兵蚁很少,这都给白蚁的分类带来了较大的困难。
        基于聚合酶链式反应( Polymerase chainreaction, PCR)技术为物种鉴定提供了新的手段,弥补了传统形态鉴定的诸多不足[8]。该技术通过引物和模板DNA特异性的结合, 可在短时间内扩增出数百万特异DNA序列拷贝。它具有如下几个优点:1)不受白蚁组织类别、发育阶段等影响。DNA上得到的信息不会随白蚁发育时期的不同而变化。(2)不受环境影响。因为环境只影响基因表达,而不改变基因的核苷酸序列。(3)DNA分子标记技术简单、快速、易于自动化。(4)提取的DNA样品,在低温下可长期保存[9]。因此,近年来分子生物学技术被越来越广泛地应用于白蚁分类研究中。线粒体编码细胞色素c氧化酶亚基Ⅱ基因(COⅡ)已成为当前动物分子系统中应用最广泛的分子标记[10]。Jenkins等首次利用COⅡ基因序列推断台湾乳白蚁入侵危害的途径[11]。Miura等利用线粒体COⅡ基因和翻译的蛋白质序列对进化较高的白蚁科和鼻白蚁科15个属的系统发育关系进行了研究[12]
        本研究在镇江市范围内采集白蚁标本,并采用基于COⅡ基因部分序列的PCR产物直接测序法鉴别确认白蚁种类,该研究可为今后开展白蚁种群分布和危害调查提供科学基础,从而进一步掌握蚁害发生特点,提高白蚁防治水平。
    2.材料和方法
    2.1材料和仪器
    2.1.1材料和试剂
        一次性组织研磨棒、1.5mL离心管、200μL PCR薄壁管,1000μL、200μL、10μL枪头、上下游引物均购自生工生物工程(上海)股份有限公司;Takara r-taq 酶(250U)、Takara DL 2000 DNA marker(500μL)购自上海皓嘉科技发展有限公司;EasyPure Genomic DNA提取试剂盒、Axygen胶回收试剂盒、Biowest Agarose琼脂糖(100g)购自南京百斯凯科技公司。
    2.1.2仪器设备
        梯度PCR仪、琼脂糖水平电泳仪、手提紫外分析仪、Fresco 21微型离心机、凝胶成像系统、电子分析天平(0.0001g)、全自动蒸汽高压灭菌锅、移液枪、超级恒温水浴锅。
    2.2试验方法
    2.2.1白蚁样本采集
        从全市范围内,特别是白蚁危害重点区域采集白蚁标本。采集白蚁时,取活体或死亡时间少于24 h的完整成虫体,密封保存于99.9%酒精的样本瓶中,做好标签和记录。
    2.2.2白蚁组织基因组DNA提取
        选取白蚁整体为试验材料,用纸巾将样品表面的酒精和水分吸干后,称重,控制样品质量≤25 mg。样品用研磨棒研磨,采用EasyPure Genomic DNA提取试剂盒提取样品基因组DNA。最后用EB溶液进行两次洗脱,合并两次的洗脱液用于PCR反应的模板。
    2.2.3 PCR扩增COⅡ基因部分序列
    2.2.3.1引物
        通常用于种群分类分析的基因是16S rRNA、COI、COII、ND1、ND5[2]。本文采用以下引物用于片段扩增:上游引物COⅡ1:5’-CAGATAAGTGCATTGGATTT-3’;下游引物COⅡ2:5’-GTTTAAGAGACCAGTACTTG-3’。
    2.2.3.2扩增体系
        采用Takara公司生产的PCR试剂盒。反应体系50μL,包括:5μL10×buffer(Mg2+-),4μLdNTP,3μLMg2+,正反引物各1μL(20 mmol/L),1μLDNA模板,17μL灭菌超纯水。
    PCR反应条件如下:起始94℃预变性3min,然后94℃变性30s,50℃退火1 min,72℃延伸1 min,30个循环。最后72℃反应10 min。PCR产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测,并用EB染色。用DNA marker(DL2000)标记扩增片段大小,以确定是否为目的片段。电泳后置于凝胶成像系统观察。
    对于有杂质,需要纯化的PCR产物,采用Axygen胶回收试剂盒纯化后测序;对于扩增效果良好的PCR产物则可直接测序。本实验委托上海生工生物技术服务有限公司进行测序和拼接,每个样品采用正反链双向测序,以提高测序的准确度。
    2.2.4数据分析
        根据委托公司发回的测序结果,将正反链拼接得出的碱基序列在NCBI网站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上进行BLAST相似性搜索,选择相似度最高的确定为该物种。
    3.结果与分析
    3.1白蚁标本采集结果
        在全市范围内,特别是白蚁危害重点区域共收集有效白蚁标本185个。
    3.2 PCR扩增结果
        以编号zj144、zj035、zj115、zj102、zj101、zj100、zj099、zj097、zj095、zj094、 zj093、zj092的样品为例,PCR扩增结果见图1。引物对检测样本扩增出800bp左右的条带。结果显示,检测样本的PCR扩增结果与设计目标相同;同时,目标条带明亮清晰,说明PCR扩增特异性较高,效果良好,PCR产物可直接测序。
    1引物PCR扩增图(从左到右条带分别为DNA markerDL2000)、zj144zj035zj115 zj102zj101 zj100 zj099zj097zj095zj094 zj093 zj092
    3.3 测序结果
        以编号zj004的白蚁标本为例,测序后拼接得出的碱基序列如图2所示。将碱基序列在NCBI网站上进行BLAST相似性搜索,结果见图3。结果显示,zj004号样本与台湾乳白蚁这一物种的基因相似度最高,相似度达99%。同时结合形态学特征,确认zj004号样本为台湾乳白蚁。
    2 zj004号白蚁样本拼接碱基序列
    3.4鉴定结果
        185个白蚁标本采集记录及鉴定结果见表1。
    1 185个白蚁标本鉴定结果统计
    种类
    样本数量
    占全部样本比例
    黑翅土白蚁
    Odontotermes formosanus
    白蚁科土白蚁属
    41
    22.16
    黄翅大白蚁
    Macrotermes barneyi Light
    白蚁科大白蚁属
    2
    1.08
    台湾乳白蚁
    Coptotermes formosanus Shiraki
    鼻白蚁科家白蚁属
    3
    1.62
    黑胸散白蚁
    Reticulitermes chinensis Snyder
    鼻白蚁科散白蚁属
    68
    36.76
    尖唇散白蚁
    Reticulitermes aculabialis Tasi et Hwang
    鼻白蚁科散白蚁属
    34
    18.38
    圆唇散白蚁
    Reticulitermes Labralis Hsia et Fan
    鼻白蚁科散白蚁属
    35
    18.92
    黄胸散白蚁
    Reticulitermes flaviceps (Oshima)
    鼻白蚁科散白蚁属
    2
    1.08
    合计
    185
    100
        结果可见,185份白蚁标本共包含2科4属7种白蚁,分别为黑翅土白蚁、黄翅大白蚁、台湾乳白蚁、黑胸散白蚁、尖唇散白蚁、圆唇散白蚁、黄胸散白蚁。其中黑胸散白蚁所占比例最高,达36.76%;台湾乳白蚁、黄翅大白蚁及黄胸散白蚁所占比例较小,分别为1.62%、1.08%、1.08%。这4个属中,散白蚁属白蚁占全部样本比例之和达75%,明显高于其他属白蚁的比重。结果表明镇江市的白蚁种类主要集中在白蚁科和鼻白蚁科两个科,主要发生为害的白蚁种类为散白蚁,特别是黑胸散白蚁。
    4.总结与展望
        本研究在镇江市范围内采集白蚁标本185份,经分子生物学方法共鉴定出2科4属7种白蚁。散白蚁所占比例明显高于其他属白蚁,其中黑胸散白蚁比例最高,为该地区优势蚁种。
    随着分子生物学的发展,利用分子生物学技术进行种类鉴别、检测的应用越来越多[13-14]。本文利用分子生物学技术对白蚁种类做出鉴别,无论白蚁何种生物型和虫态,均可用于鉴定;同时需要的样品量少,简便快捷,提取的DNA模板可用于多次检测。但需要注意的是,要防止昆虫标本DNA降解,才能获得可靠准确的遗传信息。相信随着研究的不断深入,实验技术将不断完善和提高。在结合形态学鉴定的基础上,现代分子生物技术正成为白蚁分类鉴定的有力手段,为进一步开展白蚁的分布和危害调查提供更为坚实的科学基础,并为白蚁防治提供新的方法和思路。
     
    参考文献:
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