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  • 常德市四种主要白蚁的mtDNA RFLP指纹图谱的初步构建
  •                                           姜丽红1 邹湘武1 宁涤非1席在星 2
               (1.常德市白蚁防治所,湖南 常德,415000;2湖南文理学院 生命科学学院,湖南 常德,415000)

    摘要:线粒体DNA(mtDNA)是一种核外遗传物质。利用限制性内切酶处理mtDNA得到的限制性片段长度多态性(RFLP)既具有相对的科属稳定性,又能够反映科属间的进化关系,因而已成为动物科属鉴定和系统演化研究的一种有效遗传标记。本文以工蚁为材料,用6种限制性内切酶分析了常德市4种白蚁线粒体DNA限制性片段长度多态性,根据限制性片段差异计算了4种白蚁之间的遗传距离,利用MEGA 4软件构建了四种白蚁的系统进化树,探讨了4种白蚁间的亲缘关系,初步构建了其RFLP指纹图谱。
    关键词:白蚁;mtDNA;RFLP;指纹图谱

    Primary construction of the mtDNA RFLP fingerprints of four kinds of termites in Changde City.

     JIANG Li-hong1, ZOU Xiang-wu1,NING Di-fei1,XI zai-xing2


    (1.Termite Control Institue of ChangDe, ChangDe 415000,China;2.College of Life Sciences,

     Hunan University of Arts and Science, ChangDe 415000,China)


    Abstract: The mitochondrial DNA (mtDNA) is an extranuclear genetic material. Restriction

     fragment length polymorphism (RFLP) produced by the treatment of mtDNA using restriction

     enzyme mtDNA reflects both the relative stability and the evolutionary relationship between

     families and the genera. Thus, RFLP has become a valid genetic marker in the identification 

    of animal families and genera and the study of systematic evolution. Using worker ants as

     the study material, mitochondrial DNAs of four termite species,

    Coptotermes formosanus Shiraki,Reticulitermes flaviceps Oshima,

    Odontotermes formosanus Shiraki and Macrotermes barneyi Light were analyzed with six

     restriction endonucleases of six base pair recognition.

    According to the restriction fragment length polymorphism (RFLP),

    the  genetic distance among the four termite species were estimated.

    And the dendrograms of the four termite species were also constructed with MEGA 

    4 method. We investigated the phylogenetic relationships among the four kinds of 

    termites and construction of the four termites mtDNA RLFP fingerprints preliminary.

     Keywords: termites; mtDNA; RFLP; fingerprint

     

    引言
       线粒体DNA(mtDNA)是一种核外遗传物质,与核DNA相比,具有分子量小、结构简单、进化速度快、母性遗传、无组织特异性及提取方便等特点。昆虫mtDNA 由37个基因组成,包括2个rRNA 基因,22个tRNA基因和13个蛋白编码基因[1]。线粒体DNA显示出来的差异不是基因重组,而是基因突变的结果,所以mtDNA分析已成为研究种群遗传和系统演化的重要方法。利用限制性内切酶处理mtDNA得到的限制性片段长度多态性(RFLP)既具有相对的科属稳定性,又能够反映科属间的进化关系,因而已成为动物科属鉴定和系统演化研究的一种有效遗传标记[2]。
       白蚁(termite)是一类古老的社会性昆虫,其形态特征比较保守。白蚁的外部形态相似,体壁柔软,骨化程度低,可分类的性状较少;此外,白蚁的生殖隔离机制主要不是通过生殖器官的结构来完成的,无论雌雄,其有翅繁殖成虫的生殖器均为几块简单的骨片,分类鉴定时无法采用生殖器的特征[3]。因此,白蚁主要依靠兵蚁或有翅成虫进行分类,白蚁的成虫期较短,有些白蚁类群的兵蚁很少,且不少白蚁由于地域差异其形态有一定的趋同现象,仅仅依靠形态学进行白蚁分类通常不很可靠。分子生物学技术应用于白蚁分类研究中,这一技术有助于白蚁的分类鉴定,对深入研究物种的系统进化有重要意义。由于 mtDNA 遵循母性遗传,本文以工蚁为材料,通过6种限制性内切酶分析了危害常德市四种白蚁:台湾乳白蚁(Coptotermes formosanus Shiraki)、黄胸散白蚁(Reticulitermes flaviceps Oshima)、黑翅土白蚁(Odontotermes formosanus Shiraki) 和黄翅大白蚁(Macrotermes barneyi Light)[4]的线粒体DNA限制性片段长度多态性,依据其mtDNA限制性片段长度多态性,探讨了4种白蚁间的亲缘关系,初步构建了其RFLP指纹图谱。
    1 材料与方法
    1.1 主要试剂及仪器
      饱和酚、氯仿、EDTA、Tris、SDS、琼脂糖,溴乙锭,引物由生工生物工程有限公司合成,PCR试剂盒,紫外分光光度计,PCR 仪,电泳仪,凝胶成像分析系统,玻璃匀浆器,离心机,6种限制性内切酶
    1.2 样品采集
        白蚁标本采集于常德市河洑森林公园、德山公园。采回后存放于-80℃冰箱备用。
    1.3mtDNA的提取与纯化
      以新采集的四种白蚁的工蚁(10头)为材料,利用SDS法参照《分子克隆实验指南》[5]有关实验步骤提取mtDNA与纯化。
    1.4 酶切
      根据Kambhampati S [6]文献参考,选取6种限制性内切酶,均为识别6碱基序列,分别为Pst I、Hind Ⅲ、BamH I、EcoR I、Xho I和EcoR v,均购于上海生工公司。采用单酶切,10×buffer3μl,mtDNA 9μl,酶量为15U/管,ddH2O补充至30μl,vortex,酶解时间37℃2h-6h。
    1.5 电泳
       取9μl酶切体系,加1μl10×Loading buffer,混匀后加样于含0.5μg/ml溴乙锭的0.8%琼脂糖凝胶上样孔。0.5×TBE 电泳缓冲液,以λDNA/Hind Ⅲ 为分子量标记。电泳条件:3V/cm 恒压电泳1小时。电泳结束后将胶置于凝胶成像分析系统拍照。
    1.6 数据统计分析
      根据电泳结果即可确定酶切片段分子量的大小。数据的处理和分析目前普通采用Nei et Li[7]介绍的方法, 根据群体间(或个体间)共有消化片段的比例来决定mtDNA 的遗传相似性。计算遗传距离的公式如下:
    F=2Nxy/(Nx+Ny)                      (1)
    P=1一{[(F2+8F)-2-F]/2)} 1/r            (2)
    其中Nx和Ny分别为物种X和Y 的限制性酶切片段数;Nxy为两者共有的片段数;r为限制性内切酶识别序列的碱基数,本研究r=6。F 为两群间限制性片段共享度, P为两群间的遗传距离。然后按照MEGA 4软件构建四种白蚁mtDNA系统进化树。
    2 结果与分析
       4种白蚁mtDNA分别用Pst I、Hind Ⅲ、BamH I、EcoR I、Xho I和EcoR v进行单酶切的电泳图谱如图1-图4。1为marker,2为Pst I,3为Hind Ⅲ,4为BamH I,5为EcoR I、6为Xho I,7为EcoR V。6种限制性内切酶总共酶切出了56条带,最多的为Xho I,酶切出了13条带,每种mtDNA都有至少两个以上的酶切位点,且酶切位点也不相同,表现出良好的多态性,为白蚁mtDNA RFLP的最适限制性内切酶;最少的为Hind Ⅲ,只酶切出4条带,且有两种mtDNA上没有该酶的酶切位点,不太适合白蚁mtDNA RFLP。

    1   2    3   4   5   6   7             1   2    3    4   5   6   7

                     

    图1黄胸散白蚁mtDNA酶切电泳图谱       图2台湾乳白蚁mtDNA酶切电泳图谱

    1   2    3    4   5   6   7             1    2   3   4   5   6   7

                   

    图3黄翅大白蚁mtDNA酶切电泳图谱        图4黑翅土白蚁mtDNA酶切电泳图谱

     

    4种白蚁的mtDNA分子量均为16.3kb,酶切条带分子量如表1-表4。

    黄胸散白蚁mtDNA酶切条带及分子量大小

    Pst

    Hind Ⅲ

    BamH 

    EcoR

    Xho

    EcoR

    条带

    大小

    Kb

    9.4

    16.3

    16.3

    16.3

    8.6

    8.4

    4.8

    4.4

    3.7

    2.1

    2.7

    3.2

    0.6

    1

    台湾乳白蚁mtDNA酶切条带及分子量大小

    Pst

    Hind 

    BamH 

    EcoR

    Xho

    EcoR

    条带

    大小

    (Kb)

    8.4

    16.3

    12.1

    8.4

    6.5

    8.4

    4.2

    4.2

    4.0

    5.4

    6.9

    3.1

    2.9

    4.4

    1.0

    0.6

    1.9

    黄翅大白蚁mtDNA酶切条带及分子量大小

    Pst

    Hind 

    BamH 

    EcoR

    Xho

    EcoR

    条带

    大小

    (Kb)

    8.3

    8.4

    8.1

    8.2

    8.4

    16.3

    8.0

    7.9

    3.3

    8.1

    4.4

    2.7

    3.5

    2.2

    黑翅土白蚁mtDNA酶切条带及分子量大小

    Pst

    Hind 

    BamH 

    EcoR

    Xho

    EcoR

    条带

    大小

    Kb

    12.1

    9.4

    8.0

    8.2

    8.4

    16.3

    4.2

    5.9

    5.0

    8.1

    7.4

    2.4

    0.5

    0.9

     

      根据6种限制性内切酶的酶切结果,求出4种白蚁间的限制性片段共享度,然后再求出4种白蚁间的遗传距离(表5),根据限制性酶切片段数和种间遗传距离的差异,采用MEGA 4软件构建出4种白蚁的mtDNA系统进化树(图5)。从遗传距离看,黄胸散白蚁和台湾乳白蚁间的遗传距离为0.0322,黄翅大白蚁与黑翅土白蚁间的遗传距离为0.0284,而黄胸散白蚁与黄翅大白蚁和黑翅土白蚁间平均遗传距离为0.0645,台湾乳白蚁与黄翅大白蚁和黑翅土白蚁间平均遗传距离为0.0685,相对要远得多。这说明可能是黄胸散白蚁和台湾乳白蚁先聚类成一大类,黄翅大白蚁和黑翅土白蚁聚类成另外一大类,然后二者聚类,形成系统进化树。用MEGA 4我们也可得到同样的结果如图5.这与传统的分类是也是一致的。乳白蚁属的台湾乳白蚁和散白蚁属的黄胸散白蚁属于鼻白蚁科,而土白蚁属的黑翅土白蚁和大白蚁属的黄翅大白蚁属白蚁科。

    表5 4种白蚁间的遗传距离

    种类

    黄胸散白蚁

    台湾乳白蚁

    黄翅大白蚁

    黑翅土白蚁

    黄胸散白蚁

    1

    台湾乳白蚁

    0.0322

    1

    黄翅大白蚁

    0.0623

    0.0675

    1

    黑翅土白蚁

    0.0667

    0.0696

    0.0284

    1

    3 结论与讨论
         mtDNA RFLP成功与否主要处决于酶切的效果。酶切出现问题,应根据内切酶说明书,找到酶单位定义、保存条件、酶切体系、酶切反应温度、酶是否受甲基化影响、是否有星号活性及出现星号活性可能因素等等。
    3.1 mtDNA纯度对酶切效果的影响
       纯度差或残留酶切抑制物最容易造成酶切不开或不完全。杂蛋白存在会影响酶切,表现为OD260/OD280低于1.8;抑制物常见的有酚、盐、乙醇等。这种情况只要重新提mtDNA,保证OD260/OD280在1.8和2.0即可。
    3.2 酶切体系对酶切效果的影响
       通常较大的反应体系(≥30ul),小体积中过高浓度的DNA会形成粘性DNA溶液抑制酶的扩散,并降低酶活性。较少量的mtDNA(≤1ug,或更少),酶切的会更加完全一些。特别是进37℃之前,用vortex或移液枪混一下更好,主要能保证mtDNA和酶的充分接触,酶切也就更彻底。
    3.3 酶切buffer对酶切效果的影响
       每一种限制性内切酶其buffer是不同的,且对离子浓度敏感度也不同。有些酶切的buffer中,添加了一些较为容易析出或溶解的成分,这样在酶切的buffer没有完全融化时,buffer的浓度是不均一的,造成酶切不完全。反应混合液中加入浓度为0.1mg/ml的BSA,可维持体系的稳定性。
    3.4 抑制星号活性
        在非理想的条件下,内切酶切割与识别位点相似但不完全相同的序列,这一现象称星号活性。有人提出,这种"星号"活性可能是内切酶的一种普遍特性。抑制星号活性的方法:1.  尽量用较少的酶进行完全消化反应,这样可以避免过度消化以及过高的甘油浓度;2.  尽量避免有机溶剂(如制备DNA时引入的乙醇)的污染;3.  将离子浓度提高到100-150 mM。
      mtDNA RFLP被视为一种研究物种间亲缘关系的有效遗传标记[8]。目前mtDNA RFLP已在人类亲缘关系分析[9]、绵羊分类[10]、蜚蠊与白蚁[6]的亲缘关系探讨等领域得到广泛应用。该方法具有稳定性好,避免纯化mtDNA的繁琐和成本低的优点,在mtDNA分析中广泛应用。
      在本研究的RFLP试验中, 由于没有四种白蚁mtDNA的全长序列,限制性内切酶的选用具有一定的盲目性和随机性,有时会因选用不当, 使一些具有较好多态性的位点并未鉴测出来。从mtDNA多态分析来讲,增加限制性内切酶数量能完善其RFLP指纹图谱的饱和度,使其结果更加精确。

     

    参考文献
    [1]Crozier R H et Crozier Y C.The mitochandrial genome of the honeybee  Aps melliferu: Complete sequence and genome 

    organization[J].Genetic. I993,133:97~117
    [2] 邢连喜,程家安等.四种白蚁的线粒体DNA 限制性片段长度多态性研究。昆虫分类学报[J] 1999(21)3:181-185
    [3] 中国动物志,昆虫纲 第十七卷,等翅目[M].科学出版社.
    [4]姜丽红,邹湘武,张健华. 常德市白蚁危害现状及防治[J]城市害虫防治,2011(3):37-40.
    [5] 萨姆布鲁克J,拉富尔D W.分子克隆实验指南(第2 版)[M].2 版.北京:科学出版社,1992:450-462.
    [6] Kambhampati S,A phylogeny of ccckroches and related insects based on DNA sequeneof mitochondrlal

     ribosomal RNA genes[J].Pro.Nath Acod Sci.USA,l995.92:2017-2020.
    [7]Nei M et Li W H,Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases_J] 

    Proc Natl Acad.Sci.USA,1979,76:5269—5273.
    [8]朱玉贤,李毅.现代分子生物学2版.北京:高等教育出版,2000
    [9]晋华黔,昱立甫.贵州祝族、苗旌、布依族和水族人群mtDNA多志性研究[J]. 遗传学报,1995.22(1):1~11
    [10]牛华锋,陈玉林等.中国绵羊品种mtDNA遗传多态性与系统进化研究[J].中国农学通报,2011.27(17):21-25

     

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